身体逐渐被“冻”住，一点小伤口就会血流不止，轻微碰撞就可能严重骨折……目前全球已知的罕见病有近7000种，其中95%仍无药可治。但在各种罕见病中，有80%是单基因遗传病，有望通过基因编辑与基因治疗得到救治，而其可能带来的脱靶风险也一直备受关注。

3月1日凌晨3:00，国际权威学术期刊《科学》（Science）在线发表了一篇名为《胞嘧啶单碱基编辑会导致大量单核苷酸突变的脱靶》的研究论文，介绍了GOTI新型脱靶检测技术，以及使用该技术首次证实单碱基编辑存在严重脱靶效应，为基因编辑的安全性评估带来了新突破。

该研究由中国科学院神经科学研究所（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室、中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组与中国科学院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所）、斯坦福大学遗传学系以及中国农业科学院深圳农业基因组研究所合作完成。

脱靶效应可能会引起癌症等多种副作用

基因是具有遗传效应的DNA片段，基因编辑就是对基因组中的特定DNA片段进行敲除、加入、替换等。去年年底，“基因编辑婴儿事件”引发了大众对于基因编辑的巨大争议，但其实并不是所有的“基因编辑”都是不合法的。

中国科学院神经科学研究所所长、院士蒲慕明介绍说：“以生殖为目的的人类胚胎基因编辑活动是国家明令禁止的，是不合法的。而对成体细胞进行编辑达到疾病治疗的目的是允许的。大家都很期待像基因编辑这样的技术能用到临床上，治疗那些曾经无法治疗的疾病，但我们也不能忘记它的安全性问题，脱靶效应就是基因编辑技术最大的风险来源。”

新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9自2012年问世以来，其脱靶风险一直备受关注。如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床的话，脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。

由于之前的脱靶检测方案都存在一些局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，所以大家对它的真实脱靶率一直存在争议。

因此，一种能够突破之前限制的脱靶检测技术，将会成为CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最终走上临床的关键。

成功建立全新的脱靶检测技术

“临床应用对于潜在风险和副作用的容忍度极低，可是之前一直都没有良好的检测脱靶效应的工具，这促使我们只能去自主研究这方面的技术。” 中国科学院神经科学研究所灵长类疾病模型研究组组长、研究员杨辉介绍说。

要想提升检测脱靶效应的精度，就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。为此，杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脱靶检测技术。

研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记↓↓

小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白，分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞，再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。

而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。

杨辉介绍说：“该技术比之前检测脱靶的方法在精度上和广度上都有了巨大的提高，足以发现之前无法注意到的脱靶位点，这使得我们终于可以比较客观地、可靠地评估基因编辑工具的脱靶率。”

世界首次证实单碱基编辑存在严重安全风险

借助于GOTI系统，团队成员先是检测了最经典的CRISPR/Cas9系统。结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。

团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3，这个系统可以精确引入点突变，在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。

然而在GOTI的检测下发现，BE3存在非常严重的脱靶，而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点，因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。

团队分析后认为，这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上，因此经典版本的BE3有着很大的隐患，目前不适合作为临床技术。

杨辉表示：“这个结果我们也很震惊，在此之前，单碱基突变技术一直被认为是一种特别安全，几乎不会有脱靶的新技术，美国那边有多家公司都在紧锣密鼓准备把这个推向临床应用了。我们认为，这一成果在一定程度上也让业界可以冷静一点，更谨慎地对待这些新技术。”

有望开发出更安全的新一代基因编辑工具

对于这一研究成果，也有人提出疑问，GOTI技术发现单碱基编辑技术存在严重的安全风险，是否说明单碱基编辑技术就没用了？这会延缓基因编辑技术发展进程吗？

蒲慕明表示，此次研究发现现有BE3等单碱基突变技术存在脱靶的问题，并不是说这个技术就没用了。很多人的遗传病是单碱基突变导致的，所以单碱基突变这个技术本身还有着巨大的价值。有了更精确更灵敏的脱靶检测技术，将来才可能以此开发出更安全的基因编辑工具。

此外，该研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，并且可以在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点，为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具，有望成为新的行业检测标准。

杨辉介绍说：“我们认为未来可以基于我们的新技术，制定一些行业标准，让这个领域有序的，健康的发展下去。”

关于该研究的后续计划，杨辉表示：“接下去要做的主要是两件事，一个是更进一步检测，看看它除了会导致异常的基因突变以外还有没有别的问题，然后在这一切的基础上，设法改进这个系统，建立一种不会脱靶，也没有其它风险的单碱基突变技术，真正做到发现问题之后，也能解决问题。”